腦膠質(zhì)瘤中BAI1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的研究
【摘要】 目的:探討B(tài)AI1mRNA表達(dá)水平與不同級(jí)別膠質(zhì)瘤間的關(guān)系。方法:選取病理分級(jí)為WHOⅡ、Ⅲ、Ⅳ級(jí)腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本依次為12例、12例、14例，正常腦組織標(biāo)本6例；提取總RNA，用半定量RT-PCR法檢測(cè)BAI1基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況。結(jié)果:BAI1mRNA在所有正常腦組織和26例（68.4%）膠質(zhì)瘤中表達(dá)。正常腦組織的BAI1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平高于膠質(zhì)瘤組，P＜0.05；各級(jí)膠質(zhì)瘤間BAI1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:BAI1基因在膠質(zhì)瘤中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平顯著性下降，在部分膠質(zhì)瘤中表達(dá)缺失。BAI1可能與膠質(zhì)瘤的發(fā)展有關(guān)。BAI1基因在膠質(zhì)瘤中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤的級(jí)別無(wú)關(guān)。
【關(guān)鍵詞】 神經(jīng)膠質(zhì) 瘤腦特異性血管生成抑制因子 基因表達(dá)
近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)：腦特異性血管生成抑制因子（brain-specificangiogenesisinhibitor1，BAI1）具有抑制血管增生作用，并特異性在腦組織中表達(dá)①。BAI1表達(dá)缺失可能與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)②。本研究采集不同級(jí)別的膠質(zhì)瘤標(biāo)本，檢測(cè)BAI1基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，探討B(tài)AI1mRNA隨膠質(zhì)瘤級(jí)別升高的變化情況。
1、對(duì)象與方法
1.1 研究對(duì)象 38例腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本均來(lái)源于2006年4月~11月的我院手術(shù)切除標(biāo)本，其中男17例，女21例；年齡9～76歲，平均（43.2±15.1）歲。均經(jīng)常規(guī)病理檢查，按2000年世界衛(wèi)生組織（WHO）中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)確定病理診斷和分級(jí)，其中Ⅱ級(jí)（星形細(xì)胞瘤、少枝膠質(zhì)細(xì)胞瘤、少枝-星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤）12例，Ⅲ級(jí)（間變性星形細(xì)胞瘤、間變性少枝膠質(zhì)細(xì)胞瘤、間變性少枝－星形細(xì)胞瘤）12例，Ⅳ級(jí)（GBM）14例。對(duì)照腦組織標(biāo)本6例，取自同期癲病例手術(shù)切除的顳葉腦組織，其中男2例，女4例；年齡14～60歲，平均（30.7±17.0）歲。標(biāo)本切除后10min內(nèi)分塊，置于液氮罐內(nèi)冷凍貯存，－80℃長(zhǎng)期凍存?zhèn)溆谩?/font>
1.2 半定量RT－PCR 采用Trizol試劑（Invitrogen公司）提取44例標(biāo)本的總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的濃度和純度，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA的完整性。符合要求的標(biāo)準(zhǔn)：OD260/OD280在1.8～2.0；電泳顯示28S/18S約為2，5S很弱或沒(méi)有。采用QuantReversetranscriptase（天根生化科技）將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR反應(yīng)分別擴(kuò)增3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）和BAI1片段，反應(yīng)結(jié)束后行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行圖像分析（天能GIS1000數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)），記錄每個(gè)條帶的灰度值，將實(shí)驗(yàn)組灰度值和與之相對(duì)應(yīng)的內(nèi)參照組灰度相比，將比值作為BAI1相對(duì)表達(dá)水平的參數(shù)。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，引物序列:BAI1上游引物：5'-CCGCTGTGTTTCCATTGACTA-3'，下游引物：5'-ACCACAAACACGGATGCTTCA-3'，擴(kuò)增片段大小為564bp；GAPDH上游引物：5'-CATCCATGACAACTTTGGTATC-3'，下游引物：5'-CCATCACGCCACAGTTTC-3'，擴(kuò)增片段大小為100bp。PCR條件為95℃4min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，BAI128循環(huán)，GAPDH26循環(huán)；72℃10min。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 各組BAI1mRNA表達(dá)水平的相對(duì)灰度值以x±s表示，采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2、結(jié)果
BAI1mRNA在6例（100%）對(duì)照組腦組織和26例（68.4%）膠質(zhì)瘤中表達(dá)。相對(duì)灰度值分別為：對(duì)照組0.870±0.140，Ⅱ級(jí)0.213±0.078，Ⅲ級(jí)0.266±0.087，Ⅳ級(jí)0.151±0.073。4組間BAI1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)＝9.378，P＝0.000；對(duì)照組高于Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤、Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤、Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤組，均P＝0.000；各膠質(zhì)瘤組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1，2）。
3 、討論
近年來(lái)，抑制腫瘤血管生成的基因治療日益受到重視。促血管生成因素與血管生成抑制因素間的平衡是新生血管是否形成的決定因素；向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染血管生成抑制因子基因，增加其在腫瘤局部的表達(dá)，有利于使這種平衡向抑制血管生成的方面傾斜，達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的。血管生成抑制因子包括血小板凝血酶敏感蛋白1（TSP1）、血管抑素、內(nèi)皮抑素、血小板4因子（PF4）、膠質(zhì)瘤源性血管生成抑制因子（GD-AIF）和BAI1等。
BAI1的胞外區(qū)含有5個(gè)TSP1重復(fù)序列，可抑制由堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）誘導(dǎo)的血管增生反應(yīng)①，其特異性在腦組織中表達(dá)，Northern雜交顯示：在胚胎和成人腦中皆有表達(dá)，但其mRNA的亞區(qū)在不同的解剖區(qū)域呈不均勻分布。BAI1mRNA的表達(dá)水平在大腦皮質(zhì)最高，小腦、尾狀核、殼核、杏仁核、海馬次之，髓質(zhì)、黑質(zhì)、下丘腦核、丘腦表達(dá)最弱，而胼胝體和脊髓組織中無(wú)表達(dá)③。這與特異性在神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中表達(dá)的神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）的表達(dá)形式類似④，而與特異性在星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)的膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）的表達(dá)形式明顯不同⑤。說(shuō)明BAI1mRNA主要在神經(jīng)元而不是星形膠質(zhì)細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄表達(dá)。Nam等②發(fā)現(xiàn)：BAI1mRNA僅在26例GBM中的9例和全部5例良性膠質(zhì)瘤中表達(dá)；Kaur等⑥對(duì)28個(gè)GBM細(xì)胞系的研究結(jié)果也顯示：多數(shù)BAI1mRNA表達(dá)缺失，但在8個(gè)細(xì)胞系中仍然發(fā)現(xiàn)了BAI1mRNA。
本研究檢測(cè)了BAI1mRNA在對(duì)照組腦組織和Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤中表達(dá)的情況，結(jié)果顯示：對(duì)照組腦組織均有BAI1表達(dá)，12例Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤中BAI1表達(dá)缺失5例，12例Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤中BAI1表達(dá)缺失2例，14例Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤中BAI1表達(dá)缺失5例。BAI1mRNA在膠質(zhì)瘤標(biāo)本的表達(dá)陽(yáng)性率為68.4%，與BAI1mRNA在肺癌的表達(dá)（79.2%）⑦類似。膠質(zhì)瘤BAI1基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平顯著性低于對(duì)照組腦組織，說(shuō)明BAI1可能在膠質(zhì)瘤的發(fā)展中起促進(jìn)作用。令人難以理解的是，BAI1mRNA在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤的表達(dá)水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。高級(jí)別膠質(zhì)瘤比低級(jí)別膠質(zhì)瘤的血管密度明顯增加，且Dunn等⑧證實(shí)：在血管增生過(guò)程中具有重要作用的促血管生長(zhǎng)因子（VEGF）表達(dá)顯著增加，據(jù)此推斷，BAI1mRNA的表達(dá)水平應(yīng)該與膠質(zhì)瘤的級(jí)別呈負(fù)相關(guān)。但本研究結(jié)果卻與此推斷不符，考慮原因可能有以下兩點(diǎn)：①部分膠質(zhì)瘤雖有BAI1mRNA表達(dá)，但是不能翻譯成BAI1蛋白。基因是通過(guò)其最終表達(dá)產(chǎn)物——蛋白質(zhì)來(lái)發(fā)揮作用的，而Kaur等⑥發(fā)現(xiàn)：在8個(gè)有BAI1mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)的GBM細(xì)胞系中檢測(cè)不到BAI1蛋白，說(shuō)明BAI1可能進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，使蛋白表達(dá)缺失或表達(dá)水平很低。目前尚缺乏腫瘤實(shí)體內(nèi)的類似報(bào)道，仍需進(jìn)一步證實(shí)。②部分膠質(zhì)瘤有BAImRNA表達(dá)并且翻譯成BAI1蛋白，但是在腦腫瘤復(fù)雜的病理生理環(huán)境下，促血管生成因素和血管生成抑制因素間的平衡可被不同的方式打破，BAI1抑制血管生成的作用可能被腫瘤內(nèi)其他因子所克服。使得BAI1最終不能發(fā)揮抑制血管增生的作用，BAI1陽(yáng)性細(xì)胞仍發(fā)展成為GBM，使得BAI1蛋白陽(yáng)性和陰性GBM的血管密度并沒(méi)有顯著性差異⑥。這與結(jié)直腸癌、肺癌不同，Hatanaka等⑦和Fukushima等⑨分別發(fā)現(xiàn)：結(jié)、直腸癌和肺癌中BAI1基因的表達(dá)水平與腫瘤內(nèi)血管密度呈負(fù)相關(guān)。
本研究證實(shí)：BAI1mRNA在部分膠質(zhì)瘤中表達(dá)缺失，可能對(duì)膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展具有促進(jìn)作用。因此，BAI1可能成為腦膠質(zhì)瘤基因治療的新靶點(diǎn)。目前，此類研究已經(jīng)開(kāi)展并取得了初步成果。直接脂質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)BAI1胞外段基因到兔模型的角膜，有效抑制了角膜新生血管的生成⑩。Kang等⑾和肖新如等⑿的研究表明：轉(zhuǎn)染編碼BAI1腺病毒載體的GBM細(xì)胞系在mRNA和蛋白水平均有BAI1表達(dá)；小鼠腦內(nèi)接種GBM細(xì)胞系U87MG，腫瘤形成后在瘤內(nèi)注射BAI1重組腺病毒，腫瘤生長(zhǎng)明顯受到抑制，形態(tài)學(xué)上出現(xiàn)腫瘤廣泛性壞死、瘤內(nèi)血管密度降低等變化。這說(shuō)明BAI1可作為膠質(zhì)瘤，尤其是GBM基因療法的候選基因。
綜上所述，BAI1在部分膠質(zhì)瘤中表達(dá)缺失，但缺失的機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明。BAI1具有強(qiáng)烈抑制血管生成的作用，因此有望成為膠質(zhì)瘤基因治療的選擇之一。
【參考文獻(xiàn)】
[1] NISHIMORI H,SHIRATSUCHI T,URANO T, et al. A novel brain-specific p53-target gene, BAI1, containing thrombospondin type 1 repeats inhibits experimental angiogenesis [J].Oncogene, 1997, 15(18): 2145-2150.
[2] NAM D H, PARK K, SUH Y L, et al. Expression of VEGF and brain specific angiogenesis inhibitor-1 in glioblastoma: prognostic significance [J].Oncol Rep, 2004, 11(4): 863-869.
[3] ODA K, SHIRATSUCHI T, NISHIMORI H, et al. Identifi-cation of BAIAP2 (BAI-associated protein 2), a novel human homologue of hamster IRSp53, whose SH3 domain interacts with the cytoplasmic domain of BAI1 [J]. Cytogenet Cell Genet, 1999, 84(1-2): 75-82.
[4] MCAlEESE S M,DUNBAR B, FOTHERGILL J E, et al.Complete amino acid sequence of the neurone-specific gamma isozyme of enolase (NSE) from human brain and comparison with the non-neuronal alpha form (NNE) [J]. Eur J Bioch-em, 1988, 178(2): 413-417.
[5] REEVES SA, HELMAN L J, ALLISON A, et al. Molecular cloning and primary structure of human glial fibrillary acidic protein [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1989, 86(13): 5178-5182.
[6] KAUR B, BRAT D J, CALKINS C C, et al. Brain angiogenesis inhibitor 1 is differentially expressed in normal brain and glioblastoma independently of p53 expression [J]. Am J Pathol, 2003,162(1): 19-27.
[7] HATANAKA H, OSHIKA Y, ABE Y, et al. Vascularization is decreased in pulmonary adenocarcinoma expressing brain- specific angiogenesis inhibitor 1 (BAI1) [J]. Int J Mol Med, 2000, 5(2): 181-183.
[8] DUNN I F, HEESE O, BLACK P M. Growth factors in glioma angiogenesis: FGFs, PDGF, EGF, and TGFs [J]. J Neurooncol, 2000, 50(1-2): 121-137.
[9] FUKUSHIMA Y,OSHIKA Y,TSUCHIDA T, et al. Brain-specific angiogenesis inhibitor 1 expression is inversely correlated with vascularity and distant metastasis of colorectal cancer [J]. Int J Oncol, 1998, 13(5): 967-970.
[10] YOON K C, AHN K Y, LEE J H, et al. Lipid-mediated delivery of brain-specific angiogenesis inhibitor 1 gene reduces corneal neovascularization in an in vivo rabbit model [J]. Gene Ther, 2005, 12(7): 617-624.
[11] KANG X, XIAO X, HARATA M, et al.Antiangiogenic activity of BAI1 in vivo: implications for gene therapy of human glioblastomas [J]. Cancer Gene Ther, 2006, 13(4): 385- 392.
[12] 肖新如, 康熙雄, 趙繼宗. 血管生成抑制因子1對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療作用及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志, 2006,86(19):1342-1346.
