【摘要】目的:探討子宮內膜癌組織中中期因子(MK)及血管內皮生長因子(VEGF)的表達，為子宮內膜癌的化學防治提供實驗依據。方法:采用免疫組織化學SP法檢測49例子宮內膜癌和30例正常子宮內膜組織中MK和VEGF蛋的表達，并結合臨床病理參數進行分析。結果:子宮內膜癌組織中MK和VEGF蛋白的表達均明顯高于正常子宮內膜，MK蛋白的高表達與子宮內膜癌的臨床分期及組織學分級相關性顯著(r=1.55，P<0.01;r=1.11，P<0.05)，MK與VEGF蛋白表達陽性者VEGF明顯高于陰性者，二者呈正相關(r=1.76，P<0.05)。結論:MK蛋白過表達可能參與了子宮內膜癌的發生發展，并與VEGF相關。

【關鍵詞】中期因子;血管內皮生長因子;子宮內膜癌;免疫組織化學

隨著分子生物學技術的深入研究，表明腫瘤的形成和進展是一個多因素參與、多基因改變的復雜過程^①②。本課題擬通過免疫組織化學染色法檢測正常子宮內膜和子宮內膜腺癌患者組織中中期因子(MK)和血管內皮生長因子(VEGF)的表達水平，結合臨床病學特征進行分析，判斷其作為子宮內膜腺癌惡性程度評估和判斷預后的價值。

1、資料與方法

1.1 一般資料

49例子宮內膜癌標本取自2003年8月至2009年10月河北醫科大學第二醫院住院患者，年齡35～82歲，平均年齡52歲，所有病例術前均未作放療或化療，術后經病理證實為子宮內膜樣腺癌。按國際婦產科聯盟(FIGO)2000年修訂的臨床分期標準：Ⅰ期20例，Ⅱ期24例，Ⅲ期5例;按《婦產科學》第6版病理學分級標準：高分化17例，中分化23例，低分化9例。正常子宮內膜組織30例取自子宮肌瘤手術患者，經病理證實。

1.2 試劑

濃縮型羊抗人MK多克隆抗體購自美國SantaCruze公司，工作濃度為1∶100。即用型鼠抗人VEGF單克隆抗體、免疫組化S P試劑盒及顯色底物DAB購自福建邁新生物技術有限公司。

1.3 免疫組化SP法

步驟按說明書操作，石蠟切片脫蠟至水，3%H2O2孵育10min，熱抗原修復，正常山羊血清封閉，滴加1∶100稀釋的一抗MK、即用型VEGF抗體，4℃過夜，依次滴加生物素標記二抗，辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，DAB顯色，復染，乙醇脫水，二甲苯透明，封固。用已知陽性片作陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照，每例標本常規進行HE染色。

1.4 結果判斷

MK蛋白和VEGF蛋白均以腫瘤細胞胞質內出現棕黃色顆粒為陽性，參照Muramatsu^③的判定標準，隨機選取5個高倍視野，計算著色腫瘤細胞占細胞總數的百分比，記錄染色強度分級，VEGF陽性細胞0%為陰性(-)、1%～25%為弱陽性(+)、26%～50%為中度陽性(++)、>50%為強陽性(+++);MK陽性細胞0%為陰性(-)、1%～5%為弱陽性(+)、6%～15%為中度陽性(++)、>15%為強陽性。

1.5 統計學分析

應用SPSS13.0統計軟件，計數資料采用χ2檢驗，相關性分析采用Spearman等級法，P<0.05為差異有統計學意義。

2、結果

2.1 組織中MK及VEGF蛋白

MK蛋白陽性染色定位于子宮內膜癌腺上皮細胞的胞質。49例子宮內膜癌組織中，MK表達陽性29例(59.0%)，其中強陽性10例(34.5%)，陰性12例(41.4%)，陽性7例(24.1%)。30例正常子宮內膜組織中MK表達陰性。VEGF蛋白陽性染色主要定位于子宮內膜癌腺上皮細胞的胞質。49例子宮內膜癌組織中，VEGF表達陽性33例(67.3%)，其中強陽性15例(45.5%)，陽性13例(39.3%)，弱陽性5例(15.2%)。30例正常子宮內膜組織中VEGF表達陰性。

2.2 MK及VEGF的蛋白表達與子宮內膜癌各臨床病理參數間的關系

MK蛋白的表達與臨床分期和組織學分級呈正相關(r=1.55,P<0.01;r=1.11,P<0.05)，而VEGF蛋白的表達與臨床分期呈正相關(r=1.36,P<0.01),和組織學分級無相關關系(r=0.24,P>0.05)。子宮內膜癌組織中MK及VEGF蛋白表達

2.3 MK蛋白表達與VEGF間的關系

統計學分析顯示，子宮內膜癌中MK蛋白與VEGF蛋白表達有相關性(r=1.76,P<0.05)。

3、討論

MK是1988年Muramat SU等發現的一種新基因，它與多向因子(pleiotro phin，PTN)一起組成一個新的肝素結合生長因子。人的MK基因定位于11q11.2，正常成人組織中MK的表達高度受限^④⑤。近年來，MK與腫瘤的關系成為是MK研究的熱點，大多數人類惡性腫瘤中的MK轉錄水平和蛋白表達均明顯高于正常對照組織，MK在實體腫瘤的發生發展中發揮著重要的作用。MK主要通過促進有絲分裂，抗腫瘤細胞凋亡及促腫瘤血管新生來發揮其致瘤活性。多種實體腫瘤如肺癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌和所有消化系統腫瘤均有MK的高表達，并且這種高表達與組織類型無關^⑥⑧。

VEGF被認為是刺激血管內皮細胞增殖最重要的因子之一，其主要生物學功能包括：(1)作用于內皮細胞高度特異性地刺血內皮細胞有絲分裂，刺激血管生成^③;(2)促進內皮細胞的增生與遷移;(3)增加血管通透性;(4)促進某些蛋白水解酶的作用使基質降解。它在腫瘤微血管生成和轉移中發揮了重要的作用。

本研究結果發現MK在正常子宮內膜組織中沒有表達，而子宮內膜癌組織中的陽性率為59.0%，差異有統計學意義，與Rba等^⑨的報道相一致。癌組織內過表達的MK主要定位于癌細胞的胞質。將MK蛋白表達與反映子宮內膜癌惡性生物學行為的各項臨床病理參數結合起來分析，發現子宮內膜癌組織中MK表達與腫瘤臨床分期和組織學分級顯著相關。因此，MK蛋白的表達對子宮內膜腺癌惡性程度評估和判斷預后具有一定的價值。腫瘤的發生發展有賴于血管生成，MK與腫瘤血管新生關系的研究已成為近年來國內外研究的熱點^⑩。為明確子宮內膜癌中MK蛋白的表達是否也具有促進血管新生的作用，將子宮內膜癌中MK蛋白的表達與VEGF蛋白表達聯合起來分析，結果發現，MK蛋白的表達與VEGF的表達呈正相關，因此推斷其與癌組織的血管新生關系密切，提示MK可能參與了子宮內膜癌血管形成的調控^⑾。

研究表明，腫瘤切除后血清中MK水平下降。腫瘤患者尿中MK水平亦增高，與正常人比較有統計學意義。考慮MK作為一種分泌蛋白可以從多種途徑檢測到，那么血清、尿液中監測MK水平的變化，可能有助于了解疾病進展及治療情況，MK與VEGF的聯合檢測可能為臨床惡性腫瘤的診斷和預后估計提供有力幫助。

【參考文獻】

[1]趙昕,馬淑芬.轉化生長因子β及其Ⅱ型受體表達與子宮內膜癌發生的關系.河北醫藥,2009,31：2231 2214.

[2]劉霞,張為遠,代蔭梅.子宮內膜癌相關危險因素研究進展.中國全科醫學,2009,12：1128 1131.

[3]Muramatsu H,Shirahama H,Yonezawa S,et al.Midkine,a retinoic acid inducible growth/diferentiation factor.immunochemical evidence for thefunction and distilbution.Dcv Biol,1993,159:392 402.

[4]Dai LC.Midkine translocated to nucleoli and invovled in carcinogenesis.World J Gastroenterol,2009,15:412 416.

[5]Fiegel HC,Kaifi JT,Wachowiak R,et al.Midkine is highly expressed in neuroblastoma tissues.Pediatr Surg Int,2008,24:1355 1359.

[6]Ohhashi S,Ohuchida K,Mizumoto K,et al.Midkine mRNA is overpressed in pancreatic cancer.Dig Dis Sci,2009,54:811 815.

[7]Ibusuki M,Fujimori H,Yamamoto Y,et al.Midkine in plasma as a novel breast cancer marker.Cancer Sci,2009,100:1735 1739.

[8]Xu Y,Qu X,Zhang X,et al.Midkine positively regulates the proliferation of human gastric cancer cells.Cancer Lett,2009,279:137 144.

[9]Rba SY,Noh SH,Kwak HJ,et al.Comparison of biological phenotypesaccording to midkine expression in gastric cancer cels an d their autocrine activities could be modulated by pentosan polysulfate.Cancer Lett,1997,118:37 46.

[10]Maehara H,Kaname T,Yanagi K,et al.Midkine as a novel target for antibody therapy in osteosarcoma.Biochem Biophys Res Commun,2007,358:757 762.

[11]Lucas S,Reindl T,Henze G,et al.Increased mindkine serum level in pediatric embryonal tumor patient.J Pediatr Hematol Oncol,2009,31:713 717.